【背景】
肿瘤免疫治疗的困境与细菌载体的崛起
近年来，癌症免疫治疗通过激活患者自身免疫系统对抗肿瘤，在临床中展现出革命性潜力。然而，以新抗原（neoantigen）为核心的个体化疫苗仍面临两大挑战：
1. 递送效率低：合成肽或mRNA疫苗难以在肿瘤微环境（TME）中持续释放抗原，且无法激活足够的树突状细胞（DCs）。
2. 免疫抑制屏障：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Tregs）等抑制性群体阻碍效应T细胞功能。
此时，细菌载体因其独特的生物学特性进入科学家视野：
天然肿瘤趋向性：缺氧、坏死和免疫抑制的TME为厌氧菌提供了生存优势。且这类菌可以定向定植在肿瘤中，而在其他部位引起的免疫反应较小
本文通过系统改造大肠杆菌EcN，构建出可静脉注射的细菌疫苗，在多种实体瘤模型中实现高效、安全的免疫治疗。
【摘要】
工程菌疫苗的核心设计逻辑
本研究通过多次基因编辑，分别为：
1. 使用甘氨酸-色氨酸接头（GS）串联19-42种肿瘤特异性突变肽，同时激活MHC-I/II。
2. 引入李斯特菌溶血素O（LLO），在抗原呈递细胞溶酶体内内表达，促进抗原逃逸至胞质，促使抗原呈递细胞释放更多的细胞因子。
3. 安全性保障：敲除Lon/OmpT蛋白酶及隐性质粒，提高免疫细胞激活效率的同时削弱菌体在血液及其他富养组织存活能力，实现肿瘤特异性定植。
【湿实验】
血清中大肠杆菌的存活能力大幅降低
1. 菌株改造
（1）用Cas9-mediated双链断裂敲除EcN隐性质粒，即用pFREE或pCryptDel4.8删除隐性质粒（pMUT1/2），提高载体质粒稳定性，并拷贝数提升30倍。同时避免了潜在抗药性基因的存在，增加了细菌疫苗的安全性。
（2）敲除了蛋白酶基因Δlon/ΔompT以防止新抗原降解，使EcNc中抗原总积累量达野生型的80倍。且Δlon与大肠杆菌生物膜的形成相关，它的敲除降低了血清中大肠杆菌的存活能力。
（3）引入了LLO表达系统。pH依赖的溶血素O在巨噬细胞吞噬体的酸性环境中激活，促进抗原逃逸。抗原通过 MHC-I 途径 呈递，激活 CD8+ T 细胞。同时吞噬体膜损伤触发危险号（如钙离子内流、活性氧释放），激活 NLRP3 炎症小体。促进 IL-1β 和 IL-18 分泌，驱动Th1型免疫应答。
敲除基因Δlon/ΔompT，固化隐性质粒均可提升目标蛋白表达量，且效果可叠加
2. 体外验证：抗原递送与免疫激活
巨噬细胞吞噬实验：
改造菌株（EcNcΔlon/ΔompT）由于其新抗原较高的表达量以及GS接头串联MHC双激活路径，使得骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）吞噬的效率提高4倍。同时Lat.A.(肌动蛋白聚合抑制剂，抑制巨噬细胞摄取抗原)对照组排除了抗原仅仅是黏附在巨噬细胞表面的情况。
通过免疫荧光验证发现LLO表达组中，抗原逃逸至胞质的比例达70%
图中绿色荧光为模拟抗原 OVA LLO+组中可观察到OVA逸散到整个细胞中.
T细胞激活实验中：
工程菌脉冲的树突状细胞（BMDCs）分泌IL-12水平提升3倍，并驱动OT-I/OT-II T细胞大量增殖。 同时，流式分析肿瘤中 PD-L1+ 粒细胞（PMNs）、 调节性T细胞（Tregs）和免疫抑制性巨噬细胞的比例。
PMNs：PD-L1+ PMNs比例显著降低（图3f左）
巨噬细胞：PD-L1+ F4/80+ 巨噬细胞减少（图3f右）。
Tregs：Foxp3+ CD4+ T细胞数量下降（图3g）
说明工程菌疫苗通过减少免疫抑制性细胞，逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态。
2. 体外疗效
对于200立方毫米大小的肠胃瘤，瘤内注射取得了极好的效果，单次注射使3/7的CT26肿瘤完全消退，且对肿瘤抑制效果明显。
在尾部静脉注射中：
在原发肿瘤组中：实验组肿瘤体积缩小80%，效果略差于瘤内注射，推测可能是因为工程菌在随体液循环到达肿瘤前就已经部分失活。这里说明设计菌株时还要考虑安全性于疗效平衡的问题
在小鼠尾部静脉注射直肠癌细胞系构建转移模型。最终癌细胞主要定植在肺部。肺转移模型组中：100%小鼠生存期延长至45天，而对照组20天内全部死亡。
且细菌疫苗形成了长期免疫记忆：治愈小鼠二次接种肿瘤后无复发。
【干实验】
1. 新抗原筛选流程
1. 新抗原筛选流程
利用全外显子测序（WE）识别肿瘤特异性非同义突变。
RNA-Seq：筛选高表达（TPM≥1）的突变基因
MHC结合预测：
使用NetMHCpan v4.1（MHC-I）和 NetMHCIIpan v4.1*MHC-II）预测IC50≤500 nM的高亲和力表位。
使用Agretopicity指数计算突变肽与野生肽的MHC结合比值（≥1.2优先选择）。
2. 抗原串联策略
连接子优化：5-mer甘氨酸-丝氨酸（GGGGS）平衡稳定性和蛋白酶敏感性。
表达验证：通过质粒拷贝数（PCN）分析和Western Blot筛选最优构建体
当接头氨基酸个数增加到10个时，对抗原产量的提升并不明显
【Highlight】
同时靶向MHC-I/II表位，激活CD4+/CD8+ T细胞协同杀伤。
LLO具有pH依赖性激活避免全身毒性，大大提高了疫苗安全性，局部促进交叉呈递。
静脉给药突破了传统瘤内注射限制，适用于转移性病灶。
定植组织专一，基本上不会对正常组织造成损伤。
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