iGEM课题分享
Nodule Factory
iGEM 2024 CAU-China
获奖情况
在2024年iGEM大赛中，CAU-China荣获金奖及最佳食物&营养课题，并获得最佳生物元件组合设计及最佳可持续发展两个单项奖的提名。
01、Background
因经济拮据而无力负担健康膳食，是全球三分之一以上人口面临的严峻问题。其造成的营养不良会进一步导致低收入，形成恶性循环。能适应贫瘠的土壤条件的豆科植物，在世界范围内被广泛种植，而其根部的共生组织，根瘤，具有天然的微好氧环境，如果能在其中生产这些微好氧营养物质，可以达到同时解决营养不良与低收入的双重困境的效果。
因此，CAU-China开发了Nodule Factory，运用合成生物学改造根瘤菌，使其具备生产EPA和DHA的能力，并设想可以通过跨膜运输，将根瘤中的营养物质运送到大豆中，让人们便捷实惠地摄取营养。
全球豆科植物产量
CAU-China开发了一个开源的微好氧生产平台，并验证了根瘤微氧生产物质的可行性，未来的队伍只需在现有基础上略微改造，就可以合成其他想要的产物。
02、Design
*设计总览
CAU-China选择费氏中华根瘤菌CCBAU45436作为底盘，构建了一套响应氮和氧变化的调节模块，并利用编码PUFA合酶和二肽醛的基因，初步证明了“微需氧工厂”的可行性。为了提高其效率，他们通过调整相关基因的表达对新陈代谢进行重编程，并设计了自杀回路以避免底盘泄漏。
Ⅰ.阻断PHB合成
PHB（聚-β-羟丁酸） 是根瘤菌的内源性代谢产物，在野生型中表达量很高。phaC2编码的PHB合酶是PHB合成途径下游的关键酶。
*相关代谢通路
CAU-China利用同源重组双交换技术敲除phaC2，导致底盘PHB合成下降，减少对乙酰辅酶A的消耗，为PUFA 的合成提供足够的底物。
Ⅱ.调节与合成模块
根据根瘤内部的微需氧环境，CAU-China设计了一个响应氮氧浓度的调节模块。
glnK启动子和nifH启动子是底盘中的两种内源诱导型启动子。其中glnK启动子在低氮条件下会启动下游基因的表达，nifH启动子在低氧条件下会启动下游基因的表达。此外，他们引入了CRISPRi，在底盘中表达一种无核酸酶活性的Cas12k蛋白，令其在sgRNA的指导下可逆地与靶序列结合而不会切割它们；通过Cas12k与下游基因的结合和解离，实现基因表达的开关。
本模块的CRISPRi系统与诱导型启动子共同形成了 “AND gate” 调控模式，实现了对下游基因的更精准调控。
调节的具体方式为：高氧和低氮下表明根瘤菌是游离的，在低氧和低氮下表明根瘤菌此时需要将较多物质和能量投入固氮功能，这两种情况下，合成模块应当受到抑制，因此glnK启动子被低氮环境激活并启动sgRNA-GFP的表达，引导组成型表达的Cas12k与gfp基因结合并阻断下游基因的转录。
而到了植物生长后期，补充施用氮肥提高了土壤中的氮浓度，从而降低了glnK启动子的活性，因此sgRNA-GFP的表达降低，从而实现在缺氧条件下由nifH启动子引发的下游合成基因的表达。
调节的具体方式为：高氧和低氮下表明根瘤菌是游离的，在低氧和低氮下表明根瘤菌在根瘤中发挥固氮功能，这两种情况下，合成模块应当受到抑制，因此glnK启动子被低氮环境激活并启动sgRNA-GFP的表达，引导组成型表达的Cas12k与gfp基因结合并阻断下游基因的转录。
而到了植物生长后期，补充施用氮肥提高了土壤中的氮浓度，从而降低了glnK启动子的活性，因此sgRNA-GFP的表达降低，从而实现在缺氧条件下由nifH启动子引发的下游合成基因的表达。
在合成模块，该项目以二肽醛和PUFA为目标产物验证根瘤工厂的功能。其中，bgc33-sfp编码一种非核糖体肽合成酶（NRPS），该酶催化二肽醛的合成；pfa生物合成基因簇编码催化DHA和EPA等长链多不饱和脂肪酸合成的PUFA 合成酶。他们还在pfa生物合成基因簇中添加了底盘内源性RBS，并优化了密码子偏好，以提高该模块的表达效率。
*响应环境中氮氧浓
度并调控产品合成
Ⅲ.自杀系统设计
CAU-China创新性地结合了CRISPRi系统和底盘内源性的毒素-抗毒素（TA）系统，将这些组分与调节模块中选取的诱导型启动子结合，这样就可以根据系统外部环境条件实现精确调节。
在该模块，编码毒素的vapC为组成型表达，编码抗毒素的vapB受启动子nifH调节。在高氧条件下，vapB的表达受到抑制。如果此时处于低氮条件下，CRISPRi系统被激活，vapC的表达也被抑制；而当根瘤菌从共生环境中逸出，进入高氮高氧的外部环境时，vapC会正常表达，而vapB继续受到高氧条件的抑制。这导致毒素水平超过抗毒素的耐受阈值，最终触发根瘤菌的自毁。
03、Result
Ⅰ.同源重组敲除phaC2
选取phaC2上下游各500bp构建“Up-Arm phaC2 + Down-Arm phaC2”同源区段，利用三亲交配法将载体转入底盘中， 根据菌落PCR，突变菌株中成功截短了目的序列。
接种栽培十五天后，各组叶绿素含量和地上干重无明显差距（左图）；又做栽培21天的实验，结果显示接种的∆phaC2突变体不影响作物地上部分的生长（右图）。
为了确保PHB合成被顺利阻断，他们利用透射电镜观察菌体内PHB颗粒的分布，结果显示∆phaC2突变体中的PHB合成确实受到了显著抑制。
最后，他们使用薄层色谱法分析重组菌株中三酰甘油（TAG）的量，指征脂肪酸含量。可见∆phaC2突变体中TAG含量显著增加，证明phaC2基因的缺失可提高乙酰CoA水平进而促进脂肪酸合成。
Ⅱ.调节模块
CAU-China首先对glnK启动子进行单独验证。他们构建了“启动子+荧光蛋白”系统，将其转入大肠杆菌DH5α，利用无氮M9培养基进行培养并建立氯化铵浓度梯度，孵育过夜后测定OD600值以及菌液的荧光强度。显然，无氮条件下荧光强度显著高于所有含氮组，证明glnK可在低氮诱导下启动表达。
随后他们对nifH启动子进行验证。他们构建了nifH+gfp并与glnK+sgRNA-GFP一起进行无缝克隆，随后在1g/L NH4Cl的M9培养基中培养该质粒转化的根瘤菌，高氮环境将使glnK启动子无法表达crispri系统。分别在低氧和高氧条件下孵育 24 小时后，检测荧光强度，成功验证了nifH启动子被高氧条件抑制。
通过三亲接合法将构建好的调控模块导入根瘤菌后，系统在不同环境条件下的响应表现出高度特异性。他们设置了高氮高氧、低氮高氧、高氮低氧以及低氮低氧四组对根瘤菌进行孵育，测定荧光强度及OD600值。在高氧条件下，nifH启动子受到抑制；在低氮条件下，glnK启动子得到促进，sgRNA的表达上调，指导Cas12k蛋白抑制荧光蛋白的表达，在最佳诱导条件（高氮低氧）下表达强度最高。
但在预期结果之外的是，低氮和高氧条件下都诱导了高表达，推测这是启动子的组成型表达不受抑制造成的，也存在泄漏表达的可能。
Ⅲ.合成模块
首先，为了验证质粒是否会对根瘤的生长造成应激，CAU-CHINA利用nifH启动子与完整或一半的二肽醛合成基因簇构建复合回路。接种21天后，两种重组菌处理组的地上部分干重均显著降低，表明外源基因表达可能对宿主产生了代谢负担，但二肽醛合成基因簇是否完整对此并无影响。
他们从bgc33基因上与启动子距离逐渐增加的位置设计了三对引物，检测不同部位的表量。RT-qPCR结果显示，bgc33基因的转录效率随其与启动子距离的增加呈梯度下降趋势，距离每增加1kb转录水平下降约40%。
在产物验证中，质谱分析只可在原液中检测到目标产物的特征峰，浓度仅为nM级别。结合RT-qPCR结果，转录水平较低、mRNA半衰期缩短是导致产物积累不足的主要原因。
随后，他们针对多不饱和脂肪酸（PUFA）的合成进行验证。可惜的是，按设计完成分子克隆后，他们测序发现了几个无义突变和点突变，只好在修复突变后又设计了一个利用nuoA组成型表达的简易线路，成功实现重组质粒在大肠杆菌中的组装和表达。
RT-qPCR结果显示pfa基因整体表达上调，尤其靠近启动子一端表达较高，而远端基因表达下降，可能因mRNA降解或转录后结构不稳定所致。
虽然在重组菌株原液中没有鉴定出DHA和EPA的存在，但薄层色谱分析显示三酰甘油含量提升，而气相色谱进一步发现一种在野生型中未检测到的十四碳饱和脂肪酸，提示合成模块具有部分生物合成功能。
最终的脂肪酸组成分析表明，+pfa菌株中不饱和脂肪酸占比显著下降，尤其在C18系列中，表明可能存在还原酶过度表达造成的去不饱和化现象。
虽然未能检测到目标产物DHA和EPA，但实验结果从多个层面展示了pfa基因簇在异源宿主中具有表达能力，并能驱动新脂肪酸的合成。
Ⅳ.自杀模块
通过荧光强度和OD600值变化对自杀模块功能进行功能验证。在低氧条件下，不同氮浓度引起荧光表达显著变化，符合系统设计预期；而在高氧条件下，氮浓度对表达影响减弱，可能因毒素表达扰乱环境所致。OD600监测结果显示，随氮源浓度升高，菌液密度明显下降，支持模块能在高氮条件下诱导细胞死亡。
最后，菌落表型观察发现，在高氮高氧环境下长期培养，会导致重组菌株在固体培养基上逐渐由乳白色变为透明，说明毒素表达导致菌落死亡，进一步验证自杀回路在特定条件下能有效启动。该系统为根瘤共生细菌中合成生物学元件的精确调控与生物安全控制提供了有力工具。
04、Dry Lab
CAU-China建立了一系列数学模型，包括豆科植物根中根瘤菌感染和根瘤形成的模型，氮调节蛋白-DNA 对接模型、氮扩散模型、两个预测 DHA 合成的模型和一个自杀回路模型。并且开发了POMPC软件（Prediction Of
Metabolism Pathway Changes）通过输入相关底物浓度来直接访问预期产物的含量，性能良好，应用范围广，无需联网且对非专业用户友好，输入底物可查询相关通路。
CAU-CHINA为模拟中华根瘤菌在大豆根部的侵染及根瘤形成过程，构建了一个三维细胞自动机（3D CA）模型，以此估算根瘤中细菌数量，从而为DHA产量预测提供定量依据。模型基于文献中描述的标准感染流程，抽象出多个关键状态并制定状态转换规则，涵盖细菌附着、感染丝形成、根瘤发育和固氮等阶段。
在模型构建中，CAU-CHINA设置了包括根细胞、自由菌、附着菌、感染丝、根瘤细胞和固氮细胞在内的七种状态，使用摩尔邻域实现空间传播，并设置理想化的圆柱形根结构作为细菌附着平台。通过对邻近状态的判断与概率控制，模型可逐步演化出符合实际过程的结节形成动态。
模拟结果显示，在有限初始菌数条件下，根瘤从老师围感染点逐步扩展，最终形成固氮细胞，过程与实际观测一致。通过迭代过程中的状态计数，CAU-CHINA观察到感染丝先增加后稳定，随后根瘤迅速扩大，最终固氮细胞数量趋于饱和，成为产DHA的潜力群体（图13）。当初始菌数提升十倍后，根瘤形成速度显著加快，固氮能力细胞快速积累。
05、HP
人类实践部分主要分成可持续发展影响（从长远角度测评产品等）；综合人类实践（对专家进行采访）；教育（对中小学进行宣传）；包容实践（针对残障人士的宣传）。
采访大田种植技术指导老师胡金彪
设计iGEM主题UNO牌
于苏州工业园区调查产品产业链
【竞赛报名/项目咨询+微信：mollywei007】
