iGEM课题分享
Mangroves PE＆CO2Hunters
iGEM 2024 BNUZH-China
获奖情况
在2024年iGEM大赛中，BNUZH-China荣获金奖并斩获TOP10大奖，获得最佳生物修复课题、最佳综合HP、最佳建模、最佳Wiki四项单项奖项的提名。
I. Background
红树林是生长在热带、亚热带沿海潮间带或河口的木本植物群落，拥有“沿海守护者”的称号。然而，红树林被洋流所携带的大量微塑料(microplastics/MPs)污染。
红树林中微塑料能吸附毒素，危害野生生物的营养摄入，具有导致物种灭绝的隐患。港珠澳大湾区拥有超过11000公顷的红树林，其中微塑料的积累会污染水体、危害水生生物、乃至于危害人体健康，因而该问题的解决拥有重要意义，项目 Mangroves PE&CO2 HUNTERS 也就此诞生了。
据测算，港珠澳大湾区的红树林中微塑料大多以PE为主要成分，故该课题聚焦于设计工程菌解决PE积累的问题。
图1-1 微塑料在红树林土壤沉积物的垂直分布情况
图1-2 不同区域微塑料构成
FT：福田红树林；QAD：淇澳岛红树林
IN：森林内；FR：森林边缘
II. Design
PE降解部分 设计
首先，BNUZH-China设计了一个组合蛋白，将建模预测获得的PE结合肽(PE binding peptide, PEBP)和PE酶(PEase)相偶联，通过疏水作用力和范德华力与微塑料的作用，实现微生物在微塑料处的富集，并提高降解效果。
此外，为了将 PEBP-PEase 固定在工程菌外膜上，他们提高 PEBP-PEase 融合蛋白与微塑料的接触效果，他们设计将 PEBP-PEase 锚定在外膜的自转运蛋白(autotransporter)上。他们预测了自转录蛋白 estA 的 β-桶 结构和 信号肽 结构(signal peptide/SP)的分界点，将PEBP-PEase插入其中，以实现融合蛋白在外膜上的定位(图2-1)。
图2-1 微塑料初步降解设计
为实现进一步的降解，BNUZH-China设计了两个系统，辅助 PAO1 内源性的代谢流程以降解PEase产生的烷烃，形成CO2。
第一套系统构建了融合蛋白 AlkB2-Rd45-Adh(图2-2-1)，其中膜上的羟化酶 AlkB2 能羟化直连烷烃，使之成为醇，并转移醇到胞质内。但由于单加氧反应需要氧化还原能力，为加强反应，他们在alkB2基因后插入了Rd45，使 AlkB2 能偶联更少的氧化还原蛋白而发挥更好的作用。
此外，Adh 作为乙醇脱氢酶，能令 AlkB2、CYP 两通路产生的醇反应成相应的酮，同时回补羟化所产生的 NAD+ 与 NADH 比例的变化，以降低对后续的内源性代谢过程的影响。
由于 AlkB2-Rd45-Adh 仅对长链和中链烷烃有效，故又引入了 P450camY96F 酶(cypY96F基因)(图2-2-2)，以补充对短链烷烃的降解能力。
图2-2-1 AlkB2 降解系统设计
图2-2-2 CYP 降解系统设计
图2-3 工程菌内后续内源性降解
此外，考虑到工程菌的工作环境涉及土壤深层，然而 PAO1 为好氧菌，故需提高其厌氧环境的抗性。为实现此目的，BNUZH-China向工程菌内导入了vbg基因，一种单结构域血红蛋白 VHb 改造后对应基因。
改造后 VHb 能有效结合氧气，与终末氧化酶交互转移 O2到呼吸链中，并显著增强 NAD+ 再生能力。此外，其还与转录调控因子交互，激发胞内氧化磷酸化，促进内源性降解过程。
图2-4 深层降解设计
CO2传递部分 设计
为了提升菌株降解能力，同时希望能够处理二氧化碳溢出的现象，BNUZH-China 打算以沼泽红假单胞菌为底盘，设计另一个固碳工程菌。而如何连接这两个工程菌的物质交换成为了关键问题。
为了解决该问题，BNUZH-China希望通过促进细胞外电子转移(EET）提升其电子传递能力，提高 CO2转换为碳酸氢根的比例，促进两类菌之间的碳元素传递。
具体而言，他们以 PAO1 为底盘设计了一个优化设计的表达高导电性菌毛的基因 PaPilA1–61M3 ，同时将 nqrf 基因(促进吩嗪的还原，以促进能量产生和质子动力的建立)上调，以优化电子传递效果，提高两菌间传递碳元素的能力。
同时，他们选择将多拷贝的 psCA1 基因(PAO1 内源基因，表达物催化 CO2转化为碳酸酐)转入 PAO1，并设计通过内源性的 BicA 将碳酸酐转运出 PAO1。
此外，他们设计利用 CGA009 内源性的 ABC 转运蛋白，将碳酸酐转入细胞内，再用多拷贝形式上调编码 α-CAs 的 acaP 基因，提高碳酸酐转化为 CO2的速率，然后利用 CGA009 内源性的 Rubisco 酶和 CBB(Calvin-Benson-Bassham)循环固定 CO2为纤维素。
图2-5 碳元素传递部分设计
CO2固定部分设计
葡萄糖作为细菌纤维素的前体，其合成需要3-磷酸甘油醛，而胞内 NADPH 水平限制了 R. palustris CGA009 通过卡尔文循环生成3-磷酸甘油醛的效率。由于卡尔文循环受 NADPH 和 NADP+ 浓度制约，因此，提高胞内 NADPH 和 NADP+ 水平的合成生物学策略对提高卡尔文循环效率具有重要意义(图2-6)。为提高CO2固定效率，BNUZH-China设计了如下四个模块：
一、NAD+ 的从头生物合成。缺乏 NAD+ 可能会对 R. palustris CGA009 造成不利影响。NMN是其重要前体，引入编码基因 nadK，以直接将 NMN 转化为 NAD+，避免 NAD+的损耗。
二、NADP+ 的生物合成。为了提高 NADP+ 的合成，引入了 R. palustris RCB100 中编码 NADK(NAD 激酶)的nadK基因。
三、促进NADPH的转化。为提高 NADP+ 转化为 NADPH 的初始速率，引入E. coli MG1655 中编码 PntAB 的基因pntA和pntB(图2-7)。
四、增加固碳量。通过增加纤维素含量可以实现生物固碳含量的上升。 BcsA 和 BcsB 是负责纤维素链合成的核心催化子单元。因此，该课题通过从 Pseudomonas pactida NBRC 14164 中获取bcsa和bcsb基因来增强纤维素的合成。
图2-6 固碳流程图
图2-7 工程菌内 NADPH 生物合成通路
自杀系统设计
在生物安全方面，BNUZH-China通过hok/sok这一毒素-抗毒素系统，实现完成任务后自杀的效。其中，hok是致毒基因，mok是生成hok的引导肽，sok是能够表达一种小反义RNA 的抗毒基因，该 RNA 与 mok RNA 结合会导致复合物被降解，使得mok无法表达，从而无法产生 hok 毒素蛋白。
同时sok由强启动子驱动，而hok/mok由弱启动子驱动，正常细胞中由于 sok反义RNA 数量较多，使得毒素无法表达故而存活(图2-8)。
图2-8 hok/sok系统工作原理
为防止该质粒丢失，通过sok与mok的 RNA不同的降解速率来实现。由于 sok反义RNA 的降解速率远快于 mok RNA，假设工程菌的质粒意外丢失，而hok/sok系统无法表达，细胞中剩余的 mok RNA 在 sok反义RNA 降解后依然表达杀死细菌(图2-9)。
此外，由于预期的工程菌是在红树林环境中发挥作用，而红树林周边有高浓度的柠檬酸盐，故可以根据感知柠檬酸盐的浓度作为判断工程菌是否离开红树林环境的标准。因此，他们使用了来自 opdH-tctCBA-tctDE 操纵子系统的启动子 PopdH作为sok的启动子。
当周边环境中没有柠檬酸盐时，来自 opdH-tctCBA-tctDE 操纵子系统的 tctD 会特异性地结合到 PopdH上并抑制其活性；然而，当柠檬酸盐存在时，tctD 会与柠檬酸盐结合，不再抑制启动子，启动子正常表达，工程菌可正常存活(图2-10)。
图2-9 hok/sok系统应用于防止质粒丢失
图2-10 hok/sok系统应用于检测柠檬酸浓度
III. Result
PE降解 功能验证
BNUZH-China 将表达alkB2-Rd45-adhA融合蛋白、表达cypY96F和vgb的两类工程菌分别放于含微塑料环境中培养七天，发现微塑料质量变化相对野生型PAO1对照组都仅小0.004g，变化微小。
但经FT-IR检测(图3-1)，发现实验组相对对照组微塑料的PE相关化学键信号强度降低，说明确实存在降解过程。
又经SEM扫描电子显微镜观察微塑料颗粒(图3-2)，发现实验组颗粒半径变小、存在破碎现象，证明了PE降解的功能存在。
图3-1 微塑料FT-IR结果
图3-2 微塑料SEM结果
此外，BNU-China还对自主设计的PEBP(PE binding peptide)进行PE结合实验，利用绿色荧光蛋白GFP融合标记PEBP，分离纯化出蛋白后用塑料孵化，观察绿色荧光信号(图3-3)。结果表明PEBP确实具有PE结合能力。
可惜的是，课题组并未能成功表达出PEBP-PEase蛋白，故仅用建模软件预测融合后蛋白结构(图3-4)，预测结果显示融合不会对两者的功能产生影响。
图3-3 微塑料与PEBP-GFP结合结果
图3-4 PEBP-PEase结构预测
电子传递 功能验证
BNUZH-China用NADH Assay Kit和WST-8测量了NADH和NAD+浓度(图3-5)。结果表明导入nqrf确实提高了 NADH还原酶 活性，提高了 吩嗪还原酶 活性，其理论的电子传递效果会更佳。
BNUZH-China还用银染法标记菌毛，镜检结果(图3-6)表明pilA有效提高了菌毛长度。
图3-5 nqrf对菌内 NADH 与 NAD+ 影响
图3-6 pilA对菌毛长度影响
此外，课题组通过测量细菌液的电导率MFC，发现实验组电导率电导率均提升，说明所导入质粒发挥作用，且随着时间增加，电子通过鞭毛传递增强并后续保持在一个高值。
图3-7 narf、pilA工程菌电压随时间的变化趋势
CO2固定 功能验证
BNUZH-China使用FT-IR进行纤维素生产验证(图3-8)，发现实验组纤维素的特征峰(如3300-3500cm⁻¹的 -OH 振动、1100-1030cm⁻¹的 C-O-C 振动)明显，对照组因产量低未检测到明显信号，说明构建工程菌可以产生纤维素。
此外，他们通过刚果红染色发现工程菌 DH5α/pBBR1MCS2-bcsA-bcsB染色后出现红色复合物，而空载体(DH5α/pBBR1MCS2)和野生型(DH5α)无显著红色，证实纤维素合成功能。(图3-9)
可惜的是，课题组因工期不足，虽成功构建nadM-nadK-pntA-pntB质粒系统，但未能完成实际的固碳功能检验。
图3-8 纤维素含量的FT-IR测定
图3-9 菌落纤维素含量 Congo Red 染色结果
图3-10 nadM-nadK-pntA-pntBPCR产物电泳结果
自杀系统 功能验证
为了验证工程菌中自杀系统对柠檬酸盐浓度的敏感性、自杀系统杀灭工程菌的能力，BNUZH-China构建了两种功能质粒。其中，pAB1-PopdH用于验证启动子 PopdH对环境柠檬酸浓度存在感应， pAB1-hok/sok则用于验证自杀系统杀灭能力和维持质粒稳定性的能力。
为验证该系统对质粒丢失的影响，该团队进行了传代培养。在含Amp抗性的LB培养基中，分别接种携带或未携带hok/sok系统的菌株。结果(图3-11-B)显示含hok/sok系统的菌株质粒保留率显著高于对照组，表明该系统有效抑制质粒丢失。
图3-11 抗丢失功能检测结果
为了验证自杀系统中启动子 PopdH对柠檬酸盐浓度敏感性，该实验通过梯度柠檬酸浓度实验(0-5mM)检测荧光强度(图3-12)。结果显示，未添加柠檬酸的组别无荧光信号，而 5mM 柠檬酸组荧光最强，结果证实 PopdH可被柠檬酸特异性激活，并实现环境浓度依赖性基因调控。
图3-12 PopdH功能验证结果
为了验证自杀系统的工作能力，研究者利用IPTG代替柠檬酸盐环境含量的变化(pLac替换PopdH)，结果显示具有 IPTG 的组 OD600 远高于另一组(图3-13, 3-14)，即菌密度更高，意味着 IPTG 能够诱导SOK的表达。因此，自杀的系统是有效。
图3-13 IPTG模拟柠檬酸实验的培养管
图3-14 IPTG模拟柠檬酸实验结果
共培养 验证
由于本课题的两种工程菌需要共同施布，BNUZH-China设计了相关实验探究这两种工程菌在共培养条件下对彼此的影响。
他们自行配制了体积比为1:1的LB培养基与ATYP培养基混合的共培养体系，并进行72小时生长曲线测试。生长曲线结果显示(图3-15)，两种菌在共培养体系中均能有效生长，且铜绿假单胞菌生长速度更快，符合实际生物学特性，证明共培养实验达到预期，为后续电压测试奠定基础。
图3-15 PAO1 & CGA009 共培养生长曲线
为了测试细胞外电子是否能在两种菌种之间都能高效开展转移，BNUZH-China在单独培养铜绿假单胞菌一段时间后加入沼泽红单胞菌，并检测电压变化。发现含pilA的工程菌初始产生较高电压(约15000mV)，表明其代谢活跃；但加入沼泽红假单胞菌后电压显著下降并趋于稳定波动，表明两菌间可能存在电子传递，导致电压响应减弱。
另一组实验中，携带nqrf基因的工程化沼泽红假单胞菌相较于对照组电压更强，但溶液电导率未显著变化。推测原因可能与阳离子交换膜长时间浸泡导致性能下降有关。
图3-16
IV. Hardware
在硬件部分，BNUZH-China设计了 PE 微塑料含量检测测试盒，便于长期评价环境中的微塑料含量(图4-1)。更多详细内容见2024wiki的hardware板块。
图4-1 土壤 PE 含量检测测试盒工作流程
V. HP
在HP部分，团队工作分为三块。
一、综合性实践。引入三重底线模型和利益相关者互动工具，分析项目全面性和可行性，通过iHP循环吸引利益相关者反馈，持续改进项目。
二、社会教育。开展社区细胞模型活动、高校合成生物学竞赛等，培养环保意识，激发科学兴趣，呼吁关注红树林保护和微塑料污染。
三、CO₂合作。与其他iGEM团队、非营利组织合作，举办研讨会、保护活动等，扩大影响力，共享资源，开发创新解决方案。
【竞赛报名/项目咨询+微信：mollywei007】
