文献分享 Biomolecules：盐的添加增强AFPs的IRI活性

文献标题：

The Impact of Salts on the Ice Recrystallization Inhibition Activity of Antifreeze (Glyco) Proteins

网址：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31390745/

关键词：

盐溶液; IRI; AF(G)P

概述：

本文献旨在说明在培养和低温保存介质中盐的添加会增强AFPs的IRI活性。实验发现，在AFGP1-5和含有氯离子、磷酸根离子和柠檬酸根离子的III型AFP样品中，培养90分钟后，生长的冰晶体的尺寸在统计学上小于没有添加这些盐的情况下生长的晶体。在固定的整体离子强度为100mM时制备的AFGP1-5和III型AFP样品的冰再结晶率（kd）按照阴离子的Hofmeister系列逐步下降。因此结果表明，AF(G)Ps的性能受到普通低温保存介质中的添加剂的显著影响。

主要内容：

一、实验背景：

在19世纪末，Franz Hofmeister观察并量化了加入含有相同阳离子的不同盐类所引发的蛋白沉淀，Hofmeister的原始工作指出了蛋白质沉淀的离子特异性，其中阴离子比阳离子有更明显的影响。虽然盐类对TH的增强是有据可查的，但它们在冰的再结晶抑制（IRI）活动中的作用仍未解决。因此，本文献即解决盐类的添加对AF(G)P的再结晶抑制（IRI）的影响。

二、冰再结晶抑制（IRI）试验——蔗糖夹心法：

研究IRI活性的经典定量方法，如split试验和毛细管法，对检测IRI的微小差异不够敏感。液体体积分数太低，冰体积分数太高，无法可靠地避免假阳性。  

IRI实验是在5 nM（AFGP1-5）和500 nM（rQAE）的固定浓度下进行。实验通过将2µL样品夹在两块盖板之间来制备，在连接到尼康ECLIPSE Ci-Pol光学显微镜的Linkam LTS420平台上快速冷冻（20℃/分钟）至-40℃（图1）。然后将样品在-7℃下退火90分钟，同时每2分钟拍摄一次显微照片，以跟踪冰的生长情况。

a

b

图1：a: 0%的蔗糖溶液在-7℃退火50分钟后的显微照片（左）用ImageJ（右）转换成二进制图像，以确定样品中冰晶的半径。

b: 冰晶的立方数平均半径随时间线性增加，其斜率给出了生长速度常数。

三、实验结果

选择了两种广泛研究的鱼类防冻蛋白，它们在30wt%的蔗糖溶液中的IRI活性有三个数量级的差异。

1、盐对不含AF(G)Ps的30wt%蔗糖溶液中冰晶的尺寸和生长速率的影响。

经过90分钟的退火时间，Shapiro-Wilk测试确定了所有不含蛋白质的盐溶液中冰晶半径的对数正态分布，大小在0.8和14.4微米之间（图2）。磷酸钠的数量平均半径最小（=8.0 µm），硝酸钠最大（=8.4 µm）。同样，冰的再结晶率（kd = ∂3/∂t），磷酸钠最小（kd = 7.1 µm3 min^-1），硝酸钠最大（kd = 7.9 µm3 min^-1）。

且所有这五种阴离子使冰的再结晶率大约增加了30%，从未加盐的约5.5 µm3 min^-1增加到加盐的30 wt%蔗糖溶液的7.5 ± 0.3 µm3 min^-1（图3b）。

图2：不含蛋白质的盐溶液中冰晶半径的对数正态分布

图3：b&c

2、盐对AFGP1-5的IRI活性的影响。

由于AFGPs是强效的冰再结晶抑制剂，在含有AFGP1-5的盐渍蔗糖溶液中，冰晶的<R>仍然相当小（在1.4和6.3 µm之间）（图4a），除了硼酸钠（<R>~6.9 µm），所有盐都是如此。根据LSW理论，观察到所有5 nM AFGP1-5样品的<R>3随时间的变化呈线性增长（图5a）。

钠盐极大地影响了AFGP1-5抑制冰再结晶的效力，因为在固定的AFGP1-5浓度下，盐渍蔗糖溶液的kd与φ0有很大的不同。

图4：a&b

图5：a

综上描述，该文献介绍了Hofmeister的阴离子系列对AFP的IRI能力的影响，所有的盐都增强了rQAE和AFGP1-5的IRI活性，硝酸钠的作用最弱，柠檬酸钠的作用最强。令人惊讶的是，尽管硼酸钠与AFGP1-5的羟基官能团发生反应，但仍保留了AFGP1-5的IRI活性，但是会削弱TH活性。盐的存在明显影响了AF(G)Ps的性能，它们可能被用作低温保存介质的添加剂，以抑制冰的再结晶，从而减轻低温损伤。

个人评价：

该文献所得出的结论，盐的存在明显影响了AF(G)Ps的性能，这个结果有助于更好地理解辅料（特别是盐）对低温保存配方性能的不同影响所依据的物理机制。同时，对于我们的课题也有很大的帮助，在后续AFP产品的加工过程中给，我们是否可以通过添加相关盐类物质来提高其抗冻能力，从而发挥更好的效果，并且，该文献提出一个新的检验IRI的实验方法，蔗糖夹心法，为我们的IRI的protocal提供了新的思路。