2023 HUST-China iGEM课题分享

获奖情况

在2023年iGEM大赛中，HUST-China荣获金奖并斩获TOP10大奖以及最佳气候危机课题、最佳综合HP、最佳展示、最佳合成线路、iGEM全场人气奖、最佳项目宣传视频、最佳硬件提名和最佳网页提名八项单项奖项。

一、背景

大气中CO2 等温室气体可以吸收来自太空和地球表面的长波辐射，使得低层大气和地球表面温度升高，导致全球变暖。 以火电厂为主导的能源供应模式贡献了化石燃料燃烧产生的CO2 排放总量的42.7%，显著加剧了温室效应，加重可能存在的全球性问题，包括干旱、海平面上升、极端气候、粮食减产、疾病传播等，进一步危机人类安全和健康。

因此，华中科技大学的团队希望利用合成生物学将集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）和希瓦氏菌MR-1（Shewanella oneidensis MR-1）进行改造，使其形成的共培养体系能够将发电厂废气中的CO2转化为乳酸并利用其进行微生物发电。 他们希望通过这一设计应对气候危机，解决温室气体排放量大的明显现状，改善火电厂的低能效，标本兼治。

二、原理

1.蓝藻碳代谢途径

在集胞藻PCC6803中，依靠光合机器提供的ATP和NADPH，二氧化碳经过卡尔文-本森循环以多糖形式储存并代谢成各种化合物，这些化合物可用于细胞呼吸的TCA循环中，也可进入代谢旁路，但是集胞藻属PCC 6803本身并缺乏由丙酮酸产生乳酸的途径。

图1 集胞藻PCC6803碳代谢途径

2.希瓦氏菌NAD+ 生物合成的网络

细胞中NAD（H/+）（即 NADH 和 NAD+ 的总水平）是细胞内电子的重要来源，细胞内的电子可以通过电活性微生物细胞外电子转移（EET）途径从中转移到细胞外电子受体。 细胞内 NAD（H/+） 的增加导致更多的电子从电子供体的氧化增加转移到EET通路，从而增强细胞内电子通量和 EET 速率。

图2增强希瓦氏菌MR-1 中 NAD+ 生物合成和 EET 速率的模块化设计示意图（绿色与深棕色模块示意希瓦氏菌MR-1原本NAD+合成途径）

而希瓦氏菌NAD+ 生物合成的网络结构有：

模块 1 ：通过同化 L-天冬氨酸进行从头生物合成。

模块 2 ：前体 Na（烟酸）和 Nm（烟酰胺）的挽救性生物合成。 希瓦氏菌 MR-1 可以同化 Nm 作为前体，但不能使用 Na 作为前体，因为缺乏将 Na 转化为烟酸单核苷酸 （NaMN） 的酶。

模块 3：从头和挽救性生物合成途径的共同部分的通用生物合成。 希瓦氏菌不能直接从烟酰胺单核苷酸（NMN）合成NAD+，而只能通过从NMN到NaMN再到烟酸腺嘌呤二核苷酸（NaAD）的迂回途径合成NAD+。

3.GSH代谢途径

谷胱甘肽是一种三肽化合物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成。 它以两种形式存在：GSH 和 GSSG。 还原形式 （GSH） 可以进行氧化以维持细胞内细胞环境处于还原状态。 由此产生的谷胱甘肽二硫化物——氧化形式 （GSSG） 可以通过谷胱甘肽还原酶再次还原为 GSH。 GSH是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GshA）和谷胱甘肽合成酶（GshB）的连续相互作用合成的。 GshA以谷氨酸和半胱氨酸为底物合成中间产物γ-谷氨酰半胱氨酸，然后加入GshB。

图3 谷胱甘肽代谢途径（γ-谷氨酰循环）

4.损伤抑制因子 （Dsup）的DNA保护机制

Dsup是一种具有缓步动物损伤抑制活性的特定蛋白质，以保护 DNA 免受辐射和自由基损伤。

其优点在于：

①本质上无序，使得 Dsup 能够调整其结构以适应 DNA 形状并与 DNA 互补结合。

②有大量的带电残基，净电荷为正的Dsup与净电荷为负的DNA之间存在较强的静电吸引力，可以更好地形成蛋白-DNA聚集体以保护DNA。

Ⅲ. Design

为了使得共培养体系能够有效的进行碳封存和发电，他们将设计分为三个部分：

一.使集胞藻属PCC 6803可以产生乳酸并将乳酸转运至胞外作为希瓦氏菌发电的碳源。

二.改造希瓦氏菌使其增强胞内NAD（H/+）合成，以提高EET速率发展生物燃料电池。

三.保证工程菌在强氧化废气的恶劣环境中生存。

1.乳酸生产及转运线路

团队通过在在聚胞藻属PCC 6803中引入ldhA 与lldP两个基因分别表达乳酸脱氢酶和乳酸转运蛋白，使其能够催化丙酮酸加氢产生乳酸并将产生的乳酸转运到生物体的细胞外层。由于乳酸脱氢酶以NADH分子作为辅酶，而集胞藻属PCC 6803光合作用产生的NADPH分子远远超过分解代谢产生的NADH分子。为了提高NADH/NADPH比值，他们又导入omcS基因，编码C型外膜细胞色素的氧化还原蛋白，使得光合电子传递链中多余的电子从 PQ 引导到 PSI 从而产生三种效果：

（1）提高CET（循环电子传递），增加ATP的产生。

（2）改善LET（线性电子传递），增加光反应过程中ATP和NADPH的产生。

（3）抑制RET（呼吸电子传递），使NADH能够积累，从而提高乳酸脱氢酶活性。否则将被呼吸产生ATP，从而导致NADH水平增加。

图4OmcS对中枢代谢基因表达的影响

图5 乳酸生产基因线路

2.希瓦氏菌胞内NAD（H/+）合成增强

为了能够同时吸收和代谢Na和Nm，他们引入了Na和Nm的双功能转运蛋白niaP的基因和编码烟酸磷酸核糖转移酶ycel的基因pncB；他们还引入了编码NMN腺苷酸转移酶的基因nadM，直接将NMN转化为NAD+。

此外，他们导入大肠杆菌的编码NAD+合酶的基因nadE*和编码烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶的基因nadD*，原因是其能够更加高效合成NAD+。

间接电子转移由内源性分泌的可溶性电子穿梭黄素介导。为了增加核黄素从希瓦氏菌MR-1的扩散，他们引入了孔蛋白Oprf对应基因oprf，以增加核黄素在细胞膜上的转运，从而进一步提高发电能力。

图6胞内NAD（H/+）合成增强和核黄素扩散基因线路

3.抗逆性线路设计

团队考虑到发电厂废气强氧化性对细胞生长不利，因此在集胞藻PCC6803中引入了超氧化物歧化酶（SOD）的sodA基因并过表达基因 GshA 和 GshB提高胞内谷胱甘肽水平增强工程菌抗氧化性。

针对希瓦氏菌MR-1，他们同样导入sodA基因并增加dsup基因表达以保护DNA免受辐射和自由基损伤。

图7集胞藻PCC6803抗逆基因线路

图8希瓦氏菌MR-1抗逆基因线路

Ⅳ. Result

1.工程集胞藻PCC 6803表达验证

工程集胞藻PCC6803生长状况

用BG11分别培养工程菌聚胞藻 PCC 6803（omcs）和野生型，并测定OD730每 24 小时一次。集胞藻 PCC 6803（omcs）在各阶段的细胞浓度均有显著改善，生长速率无明显下降，表明omcs可以通过增加ATP合成来提高PSI的光合效率，从而促进细胞的更好生长。

图9BG11中聚胞藻PCC 6803和聚胞藻PCC 6803（omcs）的生长曲线

乳酸生产验证

首先测量了乳酸浓度的标准曲线并确定了其保留时间，再采用冻融法破碎集胞藻PCC6803（pLactate）细胞，取离心后的上清液进行高效液相色谱（HPLC）证实了乳酸在工程细菌中的成功表达及稳定地产生。

图10 聚胞藻 PCC 6803、聚孢子虫PCC 6803（omcs）和5mM乳酸标准品的HPLC谱图。结果表明，集胞藻属PCC 6803（omcs）可以产生乳酸而野生型则不具备这种能力。

2.工程希瓦氏菌MR-1表达验证

NADH/NAD+浓度的测定

分别测量了野生型和工程菌株 ycel-pncB 和 nadD-nadE-nadM 的 NADH/NAD+ 含量，均有不同程度增加。

希瓦氏菌MR-1 （ycel-pncB） 可能有助于加速烟酸和烟酰胺的转运以进行细胞内 NADH 合成，而 S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM） 促进更有效的电子转移。

图11.oneidensis MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadE-nadD-nadM）的NAD（H/+）浓度

希瓦氏菌发电量验证

他们建立了一个微生物燃料电池装置，培养条件下外源加入乳酸并加入 0.1 mM IPTG 诱导剂以启动基因表达，使用数字万用表测量微生物燃料电池的输出电压。相比之下，与野生型相比，nadD-nadE-nadM表现出显著更高的放电峰值和更长的高效放电持续时间。最高输出电压高达150.7 mV，最高功率输出增加42.32%。

图12阳极溶液为M9缓冲液和18mM乳酸时，S.oneidensis MR-1、S.oneidensis MR-1（ycel-pncB）、S.oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）的输出电压

外源电子载流子选择

他们研究了添加光敏剂（5 μM曙红Y，5 μM荧光素）和40 μM核黄素对S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）发电的影响。结果表明，核黄素有助于发电。

图13不同外源电子载流子的输出电压

实际应用

将含有 S. oneidensis MR-1、S. oneidensis MR-1（ycel-pncB）、S. oneidensis MR-1（nadD-nadE-nadM）基因通路的微电池分别与红色 LED 灯泡连接起来。结果表明，与S. oneidensis MR-1微电池连接后，LED灯泡的亮度没有明显变化，表明S. oneidensis MR-1微电池未达到LED灯泡的工作电压，而工程菌组中的红色LED灯泡可以正常使用并发出明亮的红光。

3.共培养系统

工程菌生长状况

分别使用MBG11培养基培养集胞藻PCC 6803和S. oneidensis MR-1，每24小时测量一次OD值，并得到如下生长曲线。MBG11培养可以使集胞藻正常生长。希瓦氏菌 MR-1目前可以生长，但生长速度缓慢，造成这一结果的原因可能是缺乏营养。

图14 聚胞藻 PCC 6803和聚胞藻 PCC 6803（omcs）在MBG11中的生长曲线。集胞藻 PCC 6803（omcs）在各个阶段的细胞浓度均有显著提高，生长速度更稳定

图15MBG11中希瓦氏菌MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadD-nadE-nadM）的生长曲线

发电状况

使用 MBG11 培养基测量希瓦氏菌在对数生长阶段的发电性能，其在含乳酸的MBG11培养基中可以正常发电。

图15MBG11中希瓦氏菌MR-1（野生型）、（ycel-pncB）、（nadD-nadE-nadM）的输出电压

Ⅵ. Hardware

他们提出“积木式”发酵罐的模块化设计思路，提高了发酵系统的操作便携性和环境适应性，并针对不同发酵场景定制了相应的解决方案，确保效率最大化。

工业化设计时他们考虑到转化时的各种实际情况，包括成本、操控方法、地理条件以及如何达到实验室效果等问题进行合理改进。

图16 整体装配图（左）和工业设计图（右）

Ⅴ. HP

HUST-Cina团队在武汉科技馆进行一场关于合成生物学的儿童科学讲座，形象化地介绍了合成生物学的基础知识以及与该项目相关的具体知识，并让孩子们在“合成质粒”的游戏中理解掌握有关基因工程的知识。

他们还在校园内组织了一场面向中学生的夏令营，向他们介绍合成生物学的基本概念，并提供基本微生物实验的指导。

另外，他们还汇集华中农业大学不同学科的同学组织了一场有关合成生物学伦理的辩论，为不同的观众提供合成生物学的基础知识，并促进与iGEM团队HZAU-China的有意义的讨论。

课题亮点

1.以两种菌共培养的方式将火力发电厂产生的二氧化碳转化为电能，同时使用火力发电过程中的浪费热能培养工程菌。两种工程菌在空间上是隔离的但是他们之间又以乳酸作为中介物质联系并且处于同一培养基体系中，避免了培养基不同造成的生长障碍。

2.考虑到抗逆的基因线路，让他们的设计更加完整。实验的成果完成度也比较高。采用了MFC设计想法，并且在实验过程中做出了模型模拟，证明了用工程微生物发电的可行性。

3.人类实践的辩论赛和夏令营活动都非常有创意，值得学习。