2022 CAU-China
1、Background
石质文物以石头为原材料。这些文物常常被放置在室外，被自然环境中的酸雨、盐腐蚀，也遭受恶劣天气的影响，石质文物上的结构和图像可能会随着时间的流逝而消失。根据浙江大学张炳建教授及其团队的研究结果，由一水合草酸钙(calcium oxalate monohydrate,COM)构成的生物组织在保护石雕不被腐蚀方面发挥着重要作用。
然而，人工生产的草酸钙并不能取得很好的效果。同时，真菌产生的草酸钙保护膜也是无效的，因为真菌可能对雕像产生不良影响。因此，中国农业大学的团队希望通过对荧光假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens 2P24)进行改造，该细菌在生产外聚糖（extracellular polymeric substances，EPS）方面有很好的能力。对荧光假单胞菌进行工程化处理，使其在石质文物的表面产生紧密的COM保护膜，从而解决这一问题。
细菌可以分泌EPS，促进周围无机盐的形成和结晶，产生更稳定和更坚固的草酸钙晶体。基于以上机制，CAU团队设计了一种荧光假单胞菌去分泌EPS和草酸，让遗迹表面可以产生一水合草酸钙保护层来抵抗外界腐蚀。
2、Design
他们的总体目标可以分为三个。
第一，将EPS的相关调节因子转移到细菌中，使相关基因过度表达。
第二，将调控草酸盐合成酶和流出通道的基因转移到细菌中。
第三， 利用乳糖操纵子和光调节系统分别调节EPS的生产和草酸盐的分泌。
1.提高EPS产量
团队通过增强cdg与gacA两个基因的拷贝数，使得细菌中的EPS的产量提高，从而增强细菌生物膜的产生，提高后续草酸盐与产生与排出时的优势。
图1 生产EPS的表达通路
2.利用蓝光系统调节草酸盐的合成
团队采用蓝光调节系统来控制细菌产生与外排草酸盐的时间准确度。蓝光调节系统中的启动子Pfixk2在黑暗条件下可以诱导下游基因表达，并在受到光照时停止表达。这样的设计可以缓解细菌在非应用状态时的生存压力。
该团队转入obcA与obcB两个基因，改变了细菌体内TCA循环回路，使得细菌能够产生草酸盐。下调oxdC与gltA，减少草酸的降解和抑制草酰乙酸生成柠檬酸，增加草酸盐的产生。FpOAR作为草酸盐外排蛋白，帮助草酸盐外排至细胞外环境中。
图2 草酸盐合成外排的表达通路
图3 草酸盐合成与外排的表达通路
3.自杀开关的设计
该遗传回路是通过将两个苏氨酸启动子（PcysJ和PcysH）与毒素基因mazF和抗毒素基因mazE相结合。PcysJ和PcysH可以特异性地响应高苏氨酸浓度，激活下游基因表达，而同时使用两个启动子是为了更好地调控后面两个基因的表达。mazF的表达产物可以特异性剪接游离mRNA，抑制细菌生长。而抗毒素基因mazE的表达产物可以抑制mazF基因的作用。
在高苏氨酸浓度的条件下，这两个基因会不断表达，MazE抑制MazF的作用，细菌可正常生长。在低苏氨酸浓度的条件下，它们的表达会降低，MazE的快速降解导致MazF的作用无法被抑制，因此造成细菌死亡。
图4 自杀开关的表达通路
3、Results
1.生物膜的增强
团队采用结晶紫染色法检测生物膜产生的程度。通过转入单个基因和同时转入两个基因分别对生物膜的产生进行调节，然后通过结晶紫染色法来测定不同细菌产生的生物膜量的比较。通过实验结果可以看出，当同时转入两个基因进去的时候，该细菌的生物膜产量较其他几组是有显著增加的。同时，他们也在不同的条件下测定细菌产生生物膜的能力，通过实验发现，在０.０１M钙离子浓度，培养２８小时的条件下，生物膜的产量最高。
图5 在96孔板中进行结晶紫染色，排除位置对结晶效果的影响
图6 使用荧光单胞菌最终的测试结果（0.01 M Ca2+，0.5 M IPTG，28 h）
2.测试草酸合成能力和细菌对草酸的耐受能力
团队先对比工程菌与野生型细菌在梯度草酸浓度下的生存情况，结果表明工程菌在高浓度的草酸下生存情况较好。然后团队通过水杨酸络合铁比色法测定两种菌细胞内外草酸浓度，再对测定的浓度进行方差分析（Duncan方法）。结果表明，团队添加的Plac提高了草酸的外排效率，达到预期的实验结果。
图7 荧光假单胞菌在不同浓度草酸上的生长情况 A：实验组（导入质粒的荧光假单胞菌）B:对照组（野生型菌株）
由该图可知，实验组在０－１０ｍＭ的草酸盐浓度下生长状况并没有差异，而对照组在浓度较高的草酸浓度下，细菌明显生长状况下降。
图8 细菌内外草酸浓度测量结果
他们同时构建了一个启动子与两个启动子的遗传回路，对细菌的内外草酸浓度进行比较，图中2nd代表的是一个启动子的线路表达出来的结果，3rd是两个启动子的线路表达出来的结果。根据对比内外草酸浓度，可以得到Plac的添加提高了草酸的流出效率。
3.蓝光控制系统的检测
引入了YF1N37C突变体进入线路中，提高对蓝光系统的应答能力和调节基因的表达YF1蛋白37号位置上将Asn突变成Cys可以提高光控制系统调节基因表达的能力。他们通过设计具有突变的引物，用了DpnI选择产品的线性化突变体。对生长在含有Amp的培养基上的单克隆菌落进行了菌P和测序，生成了yf1的单克隆突变。
团队采用mCherry作为标记基因来测试光控制系统。在培养细菌并诱导，离心后在蓝光下观察（mCherry可以被激发产生红色荧光），4 h和11 h收获细菌，未检测到明显的荧光。SDS-PAGE结果中没有观察到mCherry的条带。推测可能由于启动子强度不够，导致未观察到相关现象。
图9 SDS-PAGE对mCherry的检验
4.自杀系统的验证
验证自杀系统的可行性是使用的大肠杆菌。让导入质粒的大肠杆菌和野生型大肠杆菌分别在普通LB中和含有25 g/L苏氨酸的LB中过夜培养，然后把它们再分别转移到苏氨酸培养基和普通LB培养基中，十八个小时以后分别测量他们的OD值，检测细菌生长情况。理论上，只有从苏氨酸培养基进入LB培养基的细菌会死，但是实验结果表明，这个系统好像对大肠杆菌没有影响。
图10 对大肠杆菌数目的测定结果（JEF为导入质粒的实验组）
可能是线路中使用的RBS来源于荧光假单胞菌，在大肠杆菌系统中不表达。野生型的菌株转移到苏氨酸上的实验组中菌落数目比较少，可能是因为高浓度苏氨酸会抑制细菌的生长。
选用荧光假单胞菌作为底盘重新进行实验，但是荧光假单胞菌在培养基上的生长不太稳定，就没有使用OD600的值来表示菌落数目，而是选用的菌落计数。
图11 荧光假单胞菌在不同培养基上培养的结果
图12 荧光假单胞菌数目的测定
从图中可以看出最后结果未达预期，该团队认为是大肠杆菌的启动子在工程菌中无法正常表达导致的。经过与ZJU- China的商议，他们认为可能是大肠杆菌的启动子在不同生长周期的活性不同导致的，也可能与毒素抗毒素浓度不匹配有关。除此之外，但是毒素抗毒素系统仍然有86%的抑制效率。
4. BIMP（细菌诱导的矿物沉淀）的结果
图13 200倍放大扫描石灰石的结果 A：LB对照组 B：化学矿化组 C：空白对照组 D：BIMP处理组
实验结果表明，A、C组没有明显区别，黑色石灰石表面都产生了白色杂质，B、C组形成了白色膜薄，但是化学矿化组不能覆盖石灰石表面的小的圆形凹陷，生物组则可以覆盖小的凹陷。BIMP与化学矿化的比较中，化学矿化对于石材一些细节方面的结晶效果并不如BIPM好，且晶型也较为松散。
图14 石灰石表面白色部分的占比
团队对结晶表面所占的百分比进行了统计，结果中化学矿化的效果是要更好一些的，但BIMP的产率更为稳定，团队希望再后续实验中进一步加强生物膜的产生，以增加COM的面积覆盖程度。
4、HP
在HP方面，团队与从事文物研究的方面的研究员，从事文物保护方面的博士等专家都进行了相关的对话与讨论，明确在微生物保护文物方面的相关需求与要注意的事项，为实验部分提供相应的指导。团队还从官方，研究者，文物保护工作者等多方面角度，调查它们对于利用微生物保护文物的不同的态度与看法，两方面的意见都有，使团队更加深刻以及深入的了解到微生物保护文物的可行性。
5、Hardware
在硬件方面，团队打造一套相应的装置，以套件的形式展示产品。该套件使用简单，适合批量生产。主要包括刷子、喷雾瓶、PVA膜、遮阳布、IPTG（0.5M）、苏氨酸和生物膜草酸生长液。
图15 受到环境影响的石质文物
6、Software
在模拟生物膜的过程中，团队发现生物膜中的渗透会形成营养浓度的梯度。因此，生物膜的生产效率和细菌的分裂率与其所在位置的营养浓度有关，在生物膜中是不同的。为了解决这个问题，团队建立了一个模型来预测基于泊松方程和莫诺方程的固体基质中的营养浓度。意识到iGEMer将来可能会遇到类似的问题，通过FEniCSX（一个优秀的有限元平台）制作了一个基于他们模型的软件工具。此外，为了方便那些不擅长编程的用户，团队为他们设计了一个图形用户界面（GUI）。
7、Model
为了更深入地了解项目内各环节作用机理，对复杂系统做出适当的预测，为湿实验提供反馈和建议，团队建立了一系列数学模型，包括生长曲线模型、草酸盐产生与分泌模型、杀伤开关模型、生物膜生长模型、 COM的防腐机理模型和石材风化模型。
图16 受到腐蚀影响的石质文物
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